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次世代（大規模平行）定序 (Next-Generation [Massively Parallel] Sequencing)

原理

• 高通量技術以「次世代」方法徹底改變基因檢測，其 DNA 與 RNA 定序比傳統 Sanger 法更快、更便宜。
• 又稱大規模平行定序 (massively parallel sequencing)：將片段化的 DNA 序列擴增產生數千個複本，再整批一起定序。

檢測策略的階梯

1. 多基因套組 (multi-gene panels)：以次世代定序評估與特定表現型相關的一大群基因（如表皮鬆解性水泡症、魚鱗病、血管畸形），具成本效益。
   • 舉例：頭髮稀疏、少汗 (hypohidrosis)、缺牙的病人，建立分子診斷的第一步是使用已知與外胚層發育不良相關的基因套組進行標的式檢測。
   • 標的式檢測的優點：可對編碼區與部分非編碼區做精細分析，同時偵測序列異常與缺失／重複。
2. 全外顯子定序 (WES)：用陣列特異性捕捉人類基因體的蛋白編碼（表達）區域。
   • 這些區域僅佔遺傳物質的 1%–2%（約 2%），但含 >85% 的致病突變。
   • 若外胚層發育不良病人的標的式檢測未找到致病變異，WES 可檢視更多基因的編碼區。
3. 全基因體定序 (WGS)：涵蓋更多非編碼區，但覆蓋深度較 WES 低。

WES vs WGS 現況

• 目前對於隱性與顯性遺傳疾病的致病突變鑑定，WES 加上生物資訊分析，比 WGS 更有效率且更具成本效益。
• 但基因技術快速進展，WGS 進一步優化後預期未來使用會增加。

共通注意事項

• 所有這些方法都可用從各種樣本（血液、唾液、組織）萃取的 DNA 進行。
• 沒有任何一種方法能完全排除特定疾病的可能性。
• WES 與 WGS 使用親子三人組 (parent–child trio) 樣本，有助判定哪些變異具致病性並提高診斷率。
• 需生物資訊分析依功能、同型性 (zygosity) 與族群頻率來過濾並排序所找到的變異。

表 54-6：次世代定序 (NGS) 各選項的比較。