實驗技術（EXPERIMENTAL TECHNIQUES）
組織處理（Tissue Processing）
皮膚科醫師習慣將切片檢體置於福馬林（formalin）中，接著進行石蠟包埋，然後以 hematoxylin 與 eosin 染色組織切片。然而，這只是組織處理數種可能起始點中的一種（圖 3.1）。藉由將檢體置於
福馬林中（供光學顯微鏡使用）、glutaraldehyde 中（供電子顯微鏡使用），或在處理與切片前將新鮮檢體冷凍，檢體可以多種方式進行組織學分析，包括常規染色、免疫組織化學染色（immunohistochemistry）或原位雜交（in situ hybridization）。
來自冷凍檢體的冷凍切片（cryosections），其組織結構品質低於福馬林固定、石蠟包埋組織的切片，但前者比其他固定方法更能保存 DNA、RNA 與蛋白質。新鮮或冷凍組織亦可直接以緩衝液與試劑處理，以從整塊組織中萃取 DNA、RNA 與蛋白質。此外，新鮮組織可用於製備單細胞懸浮液，以進行 DNA、RNA 或蛋白質的單細胞分析。所欲的細胞譜系（例如 keratinocytes、fibroblasts、免疫細胞、內皮細胞）可藉由使用選擇性培養基與分離技術而在體外增殖。
從組織切片中分離特定細胞群的一種方法是雷射微切割（laser microdissection），其容許選擇微解剖區域進行分析（圖 3.2）。或者，一旦組織被解離且活細胞處於單細胞懸浮液中，即可使用流式細胞儀（flow cytometry）來辨識細胞群（圖 3.3）。個別細胞在液流中通過，並穿過一組雷射與電子偵測器，後者可測量每個細胞的多項參數。螢光活化細胞分選（fluorescence-activated cell sorting, FACS）運用靜電偏轉系統，可用於取得具有特定所欲特徵的純細胞群，例如以譜系特異性抗體標記的細胞。單細胞分子生物學領域正在快速演進，藉由在一種稱為質量細胞儀（mass cytometry）的技術中結合流式細胞儀與元素質譜（elemental mass spectrometry）的原理，如今已可能分析每個細胞的 40 項或更多參數。
分析 DNA、RNA 與蛋白質之分子技術的基礎（The Foundations of Molecular Techniques for Analyzing DNA, RNA, and Protein）
分子生物學背後的概念是簡單而一致的。一般而言，它們包含萃取所感興趣的分子、將其擴增至可測量的量，然後偵測它們。聚合酶連鎖反應（polymerase chain reaction, PCR）是擴增 DNA 的標準技術（表 3.1；圖 3.4）。要執行 PCR，會使用短的合成 DNA 序列（引子，primers）與所感興趣的 DNA 區域進行雜交，該區域接著經由多個循環被複製。經 PCR 擴增的 DNA，依所設計的引子而定，典型大小為 50 至 2000 個鹼基對，可使用一種在紫外光下發出螢光的嵌入型染劑（intercalating dye）在膠體中偵測。核苷酸序列接著可經由螢光定序技術加以判定。此簡單且相對廉價的方法，亦稱為 Sanger sequencing，至今仍被廣泛使用。
然而在今日，大規模平行定序（massively parallel sequencing），亦稱為次世代定序（next-generation sequencing），提供了在單次運行中以僅略高的成本讀取數百萬個 DNA 片段的機會（表 3.2；圖 3.5）。大規模平行定序的出現不僅使人得以取得 DNA 序列，也讓人得以推斷 DNA 拷貝數的變化。這是因為最終擴增的 DNA 與原始反應中 DNA 拷貝的數量成正比，容許推斷特定基因與基因體區域的拷貝數變異。大規模平行定序的一項限制在於，其增強的效能與讀取深度需要生物資訊學與精密的資料分析，而這在臨床實務中難以標準化。
RNA 也容易純化，但較不穩定，且降解速度遠快於 DNA。因此，RNA 分析中典型的第一步是使用反轉錄（reverse transcription, RT）將其轉換為 DNA（表 3.3；圖 3.6）。在 RT 之後，所產生的互補 DNA（complementary DNA, cDNA）可如前述經由 PCR 擴增。RT-PCR 技術也已被改良，以容許對
極低量的 mRNA 進行準確的定量。由於 PCR 產物的量在每一個擴增循環中都受到監測，此技術被稱為「即時」（real-time）定量 PCR。
細胞中蛋白質的量是合成與降解在多個步驟受控下的複雜平衡，包括蛋白質轉譯的效率以及影響蛋白質穩定性的轉譯後修飾（post-translational modifications）。測量蛋白質濃度的一種方法是 Western blot，其亦被稱為免疫墨點法（immunoblot），因為使用抗體來偵測所感興趣的蛋白質（表 3.4；圖 3.7）。除了測量蛋白質濃度之外，Western blot 分析還可判定蛋白質的大小，以及是否存在該蛋白質的不同型式。另一種測量蛋白質濃度的常見方法是酵素連結免疫吸附分析（enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA；見表 3.4），可提供蛋白質的準確定量。在多工微珠免疫分析（multiplex bead-based immunoassays）中，最多可同時偵測 100 種分析物（analytes）（見圖 40.2）。為此，會將偶聯了特異性抗體、具不同螢光顏色的微珠與檢體共同培養；此混合物接著暴露於二級偵測抗體與報告分子，隨後暴露於雷射激發。此技術容許對結合至微珠的分析物量進行定量解讀。
測量組織內的細胞（Measuring Cells Within Tissues）
對於細胞群體，PCR、RT-PCR 與 Western blot 分別可用於測量 DNA、RNA 與蛋白質。然而，若要辨識細胞層級的特徵，可經由各種分析方法檢驗組織切片。例如，螢光原位雜交（fluorescence in situ hybridization, FISH）被用來評估 DNA 或 RNA 的存在或表現。此技術仰賴使用與組織切片中所感興趣之 DNA 或 RNA 序列互補、以螢光標記的核酸探針（表 3.5；圖 3.8）。探針與組織中的標的序列雜交，玻片接著使用
免疫組織化學染色被用來評估組織切片中蛋白質的表現。將抗體加入組織切片，抗體在該處特異性地結合所感興趣的蛋白質。結合的抗體通常藉由一種在結合部位產生有色產物的酵素反應而被偵測。免疫組織化學染色可用於判定組織內某蛋白質的位置與表現量，包括標記特定細胞譜系或細胞狀態（如分化、活化、增生或凋亡）的蛋白質。值得注意的是，免疫組織化學染色已演進超越單一蛋白質的定量視覺化——它也可偵測組織中特定序列的訊息 RNA（messenger RNA, mRNA）。此外，革命性的視覺化分析法運用抗體結合顯色試劑的相同原理，容許以多種抗體進行評估（multiplex IHC 與 FISH）。
測量轉錄體與蛋白體（Measuring the Transcriptome and Proteome）
有數種方法可定量分析幾乎所有細胞基因的表現量，亦即轉錄體（transcriptome）。RNA-seq 運用大規模平行定序來評估基因表現量、基因剪接（gene splicing）、非編碼 RNA、microRNA、基因融合與突變。今日亦已可能在單一細胞上執行 RNA-seq，此方法正為人類皮膚的複雜性提供新的洞見。其他方法則基於將標記的檢體 mRNA 與置於晶片、微珠或玻片（陣列，arrays）上的已知寡核苷酸或 cDNA 序列
（代表數千個基因）進行雜交。與某一給定基因之核苷酸序列的雜交程度，顯示該基因有多少 mRNA 存在。
蛋白體（proteome）代表在特定條件下所表現的全部細胞蛋白質。質譜（mass spectrometry）藉由將蛋白質離子化並測量其穿過一根管子抵達另一端偵測器的「飛行時間」（time-of-flight），提供極為準確的蛋白質質量測量（表 3.6；圖 3.9）。在多數情況下，蛋白質在質譜分析前會先以二維膠體電泳或毛細管電泳加以分離。定量則藉由以穩定同位素標記蛋白質以提供內部標準，或藉由無標記散彈式蛋白體學（label-free shotgun proteomic）方法（容許以較低成本進行更快速的分析）來達成。另一項技術是使用逆相蛋白質陣列（reverse-phase protein arrays），其中將全蛋白質裂解液點在玻片上，並使用針對特定蛋白質的抗體加以探測。蛋白體學領域可望提供關於細胞生物學與疾病狀態的大量資訊。
皮膚疾病的小鼠模型（Mouse Models of Skin Disease）
基因轉殖小鼠（transgenic mice）常被用作闡明基因體內功能的實驗模型。傳統的方法是將所感興趣的基因顯微注射入受精的小鼠卵中，該基因會隨機整合入小鼠的基因體（表 3.7；圖 3.10）。雖然當卵發育成小鼠時，該基因存在於每一個細胞中，但可藉由使用僅在特定細胞譜系中表現的啟動子（promoter），將該基因的表現限制或標定於特定組織或細胞類型。
啟動子啟動 mRNA 的表現，並位於基因編碼區的上游。例如，能確保某基因只在 melanocytes 中表現的啟動子，會是參與黑色素生合成之基因（如 tyrosinase）的啟動子。雖然每一個小鼠細胞都將含有此新基因的一個隨機整合拷貝，但由於 melanocyte 特異性啟動子，它只在 melanocytes 中表現。此原理可應用於其他細胞譜系。
基因的功能喪失亦可藉由製造「基因剔除」（knockout）基因轉殖小鼠加以研究（表 3.8；圖 3.11）。也有可能選擇性地在特定細胞類型或組織中刪除某基因（例如腫瘤抑制基因），而非從小鼠的所有細胞中刪除該基因（圖 3.12）。更進一步的精細化，是在特定的時間點觸發基因的刪除，包括在發育期間。相較於在所有小鼠細胞中刪除基因，這些可誘導系統的一項優勢是，它們可能更忠實地模擬病人特定組織中基因刪除發生的方式，忠實地重現如癌症等疾病的特徵。可誘導模型亦可規避在所有小鼠細胞中刪除基因所產生的問題，後者常影響小鼠的正常發育。除了使用 tamoxifen 來控制 Cre 的表現之外（見圖 3.12），「Tet-On/Off」系統亦可用來解決因基因刪除所致胚胎死亡的問題。
CRISPR-Cas9 基因體編輯工具的發現，已使小鼠模型的工程徹底改觀並加速進行，容許在標定的 DNA 位點精準地導入突變（圖 3.13）。CRISPR-Cas9 系統促成 RNA 導引、位點特異性的 DNA 切割，在 DNA 修復之後造成某一 DNA 區域的刪除（knockout）；或者，在修復過程中使用外源性 DNA 作為模板，這會導致新的遺傳密碼（knock-in）。這些新技術簡化了皮膚疾病模型的工程建構，並具有加速治療發展的潛力。
皮膚疾病的基因治療（Gene-Based Therapy for Skin Diseases）
基因治療是一種深具希望作為皮膚疾病治療的療法。在基因治療中，DNA 或 RNA 被操作以在標的組織的細胞中加入或矯正某一基因，藉此達成治療效果（表 3.9）。雖然此療法
可在體內直接投予至病人的皮膚，但有關於安全性以及生殖細胞系遺傳改變之潛在可能的疑慮。因此已發展出體外（ex vivo）技術，其中細胞由皮膚檢體培養而來，在體外處理後再移植回病人身上（見圖 2.7）。
由於幹細胞的基因操作可能造成長期的移植存活與穩定的效益，它們常被優先選用。然而，可從成體組織取得的幹細胞數量有限，因此利用誘導性多能幹細胞（induced pluripotent stem [iPS] cells）的基因治療引起相當大的興趣（見第 2 章）。由人類皮膚培養而來的 fibroblasts 可經由暴露於轉錄因子而被重新編程為 iPS cells；這些 iPS cells 具多能性，並可在體外無限期地增殖。來自病人的 iPS cells 可經基因矯正，接著分化為所欲的細胞類型，例如 keratinocytes，以移植回病人身上（見圖 2.7）。
在基因治療中，有數種方式可操作 DNA。為了補償某基因的功能喪失，可利用非病毒或病毒載體將該基因的一個新拷貝導入細胞。Sleeping Beauty 是一種非病毒的剪貼式（cut-and-paste）DNA 轉位子（transposon），相較於僅使用所感興趣基因之 DNA 時所得的結果，它可改善長期的基因表現。然而，該 DNA 轉位子帶有插入性突變生成（insertional mutagenesis）的風險，因為它可能隨機插入某個原致癌基因（proto-oncogene）附近而使其活化。病毒載體亦可用於導入 DNA，包括自我不活化的 lentiviral 與 gamma retroviral 載體。這些載體會整合入基因體，且相較於早期的反轉錄病毒載體，具有較低的插入性突變生成風險。然而，病毒載體也有缺點，例如免疫原性（immunogenicity）、廣泛的嗜性（tropism），以及有限的 DNA 包裝容量。
藉由矯正內源性基因而非插入一個基因，或許有可能避免插入性突變生成的併發問題。標的基因矯正的方法包括使用鋅指
核酸酶（zinc finger nucleases, ZFNs）、類轉錄活化因子效應核酸酶（transcription activator-like effector nucleases, TALENs），以及最重要的 CRISPR-Cas9（見圖 3.13）。這些核酸酶具有序列特異性的 DNA 結合模組，連接至一個 DNA 切割功能區，這使它們能在指定的位點誘發 DNA 雙股斷裂。雙股斷裂增加同源性導向修復（homology-directed repair）的頻率，使得共同遞送、帶有延伸同源臂的質體（plasmid）能夠矯正既有的基因。內源性基因的矯正為治療基因性疾病帶來希望。
另一種治療方法是標定特定的 mRNA 使其降解。設計長度為 21–23 個核苷酸、與所感興趣 mRNA 互補的雙股 RNA。這些合成的反義寡去氧核苷酸（antisense oligodeoxynucleotides, AS-ODNs）被遞送至細胞，在該處利用一個稱為 RNA 誘導沉默複合體（RNA-induced silencing complex, RISC）的內源性蛋白質複合體，介導序列特異性的 mRNA 降解。然而，AS-ODN 技術正被遞送短干擾 RNA（short interfering RNA, siRNA）與 microRNA（miRNA）的合成載體所取代（圖 3.14）。這些合成遞送載體包括脂質基礎或聚合物基礎的奈米粒子，以及共價遞送系統如動態聚合共軛物（dynamic polyconjugates）與 GalNAc conjugates。這些方法已在實驗室中被成功使用，並正在臨床試驗中接受測試。
圖 3.1：組織處理。組織檢體可用多種方式處理，以分析 DNA、RNA 或蛋白質。FACS, fluorescence-activated cell sorting。
圖 3.2：雷射捕獲微切割。雷射捕獲微切割是一種微切割方法，用於從組織切片中選擇性地取得個別細胞或細胞叢。將塗有熱塑性轉印膜的蓋帽直接置於組織切片上方。操作者以視覺辨識所感興趣的細胞，並觸發低能量紅外線雷射，使轉印膜熔附於所感興趣的細胞上。接著將蓋帽自切片上提起，以將所選細胞與組織切片的其餘部分分離。
圖 3.3：流式細胞儀。懸浮液中的細胞，預先與螢光標記抗體共同培養後，於液流中排成單列通過雷射。偵測器測量每個細胞的螢光強度。在螢光活化細胞分選（FACS）中，單細胞被分入帶電的液滴，當它們通過靜電偏轉系統時，依據所感興趣的標記被分離至不同的試管中。
圖 3.4：聚合酶連鎖反應。A 每一個循環包含下列步驟：(1) 變性——加熱至 >90°C 以分離 DNA 的兩條股；(2) 引子黏合或引子雜交——冷卻至 50–65°C 使寡核苷酸引子與模板 DNA 結合；(3) 引子延伸——DNA polymerase 在 72°C 的最適溫度下，催化與 DNA 模板互補之核苷酸（A、G、C、T）的加入，自引子開始並向 3′ 端延伸；以及 (4) 將完整循環重複 30–40 次。B 每一個循環使 PCR 產物的數量增加兩倍。n 個循環後 PCR 產物的總數將為原始量的 2n 倍。F+R, forward and reverse。
圖 3.5：大規模平行定序或次世代定序（next generation sequencing, NGS）。用於大規模平行定序的技術因不同平台而異。Illumina 平台上的工作流程可分為三個步驟：(1) 文庫製備——待測 DNA 兩側藉由接合（接合子連接，adaptor ligation）或 PCR（amplicon sequencing）加上定序接合子；(2) 定序——兩側帶有接合子的待測 DNA 與流動槽（flow cell）表面的寡核苷酸結合，DNA polymerases 催化螢光標記核苷酸的併入，並藉由影像辨識；在以酵素移除螢光基團後，併入新的螢光標記核苷酸並藉由影像讀出；(3) 資料分析——在品質管制以及將定序讀段與參考基因體對齊之後，使用計算演算法判讀（call）並註解基因異常。Freq, frequency 螢光顯微鏡。作為診斷工具，FISH 可用於偵測單一癌細胞中的基因體異常（見圖 117.19）。
圖 3.6：反轉錄 PCR（RT-PCR）。反轉錄酶可用三種不同方式將 mRNA 轉換為 cDNA，取決於所使用的引子：(1) 隨機六聚體引子（random hexamer primers）；(2) oligo dT 引子；以及 (3) 基因特異性引子。在 mRNA 已轉換為 cDNA 之後，加入能與特定核苷酸序列雜交的引子並執行 PCR。
圖 3.7：Western blot 技術。溶解的蛋白質混合物在聚丙烯醯胺膠體上分離，並以電泳轉印至一層膜上。將該膜浸泡於含抗體的緩衝液中，結合的抗體則利用標記的二級抗體（綠色星號），藉由顯色或化學發光分析加以偵測。
圖 3.8：螢光原位雜交（FISH）。顯微鏡玻片上的組織切片經固定與透化處理。切片上的核苷酸（黃色）與螢光標記（星號）的探針（深粉紅色）被變性；接著將探針加入切片，與互補序列雜交。洗去未結合的探針，並以螢光顯微鏡檢查組織。正常情況下，對於一個體染色體基因，每個細胞核會出現兩個螢光訊號，但在癌細胞中，可能只有一個訊號，表示有缺失，或有三個以上的訊號，表示有擴增。在此，一個正常的細胞核針對兩個不同的體染色體基因含有兩個綠色訊號與兩個深粉紅色訊號，而來自血管肉瘤（angiosarcoma）的組織切片使用 MYC break-apart 探針時顯示多個分離的訊號（該探針由兩段側翼序列組成，在其中曾觀察到不固定的斷點），而非僅有彼此相連的兩個訊號的兩份拷貝。FFPE, formalin-fixed, paraffin-embedded。
圖 3.9：質譜蛋白體學。第一步是降低待分析之細胞蛋白質或胜肽混合物的複雜度。使蛋白質／胜肽彼此分離的兩種主要方法是高效液相層析（high-performance liquid chromatography, HPLC）管柱或二維（2D）膠體電泳。接著進行質譜分析，首先使用雷射將分離的蛋白質／胜肽離子化為帶正電的離子。根據帶電離子的飛行時間，質譜可測量、記錄並印出每一個胜肽的質量／電荷比以及訊號強度。
圖 3.10：基因轉殖小鼠。轉殖基因構築體（定義為轉殖基因與調控區〔啟動子／增強子〕）被製備以供注射。轉殖基因被顯微注射入受精卵（單細胞期），並整合入基因體，通常整合於單一位點。這些經注射的卵接著被植入受贈母鼠體內，母鼠隨後生出異型合子的「創始者」（founder）小鼠。創始者小鼠與同一品系的正常非基因轉殖小鼠交配，然後將兩隻異型合子的基因轉殖小鼠交配。
圖 3.11：基因剔除基因轉殖小鼠。製造出含有待標定基因部分序列的標定載體（targeting vector）並導入細胞。此標定載體與該基因的一個內源性等位基因雜交，並修飾或刪除該內源性基因，使其不產生正常的蛋白質。含有被「剔除」基因的胚胎幹（embryonic stem, ES）細胞被導入早期小鼠胚胎，隨後植入受贈母鼠體內。其後代將是嵌合（chimeric）小鼠，接著與正常小鼠交配。為取得完全基因剔除的小鼠，將兩隻異型合子小鼠交配。
圖 3.12：條件式基因剔除基因轉殖小鼠。在使用 Cre-lox 系統的條件式基因剔除模型中，標的基因可在特定器官或組織中被選擇性地刪除。Cre 是一種位點特異性的 DNA 重組酶，催化兩個 loxP 位點之間的重組，造成切割、交換與接合；這導致 loxP 位點之間 DNA 的切除（以及隨後的降解）。將帶有連接組織特異性啟動子之 Cre 基因的基因轉殖小鼠，與帶有兩個 loxP 位點側翼包夾標的基因的基因轉殖小鼠交配。後代同時繼承這兩種構築體，而標的基因只在活化該組織特異性啟動子的細胞中被剔除。藉由在 Cre 重組酶上加入配體結合功能區，例如可結合 tamoxifen 者，研究者可在這些細胞中達成 Cre 表現的時序控制。標的基因可在時序上被刪除、反轉或易位，取決於 loxP 位點的方向。
圖 3.13：由 CRISPR-Cas9 技術介導的基因體工程。設計一段單導引 RNA（single-guide RNA, sgRNA），利用一段 20 個核苷酸的導引序列，標定鄰近原型間隔序列相鄰模體（protospacer adjacent motif, PAM）的基因體 DNA。髮夾結構招募 Cas9 形成複合體，並結合至標的序列。Cas9 催化 PAM 上游三個核苷酸處 DNA 兩條股的切割。雙股斷裂可經由非同源末端接合（non-homologous end-joining, NHEJ）修復，導致形成短的插入或缺失而破壞基因功能。在有 DNA 修復模板存在時，可能發生同源性導向修復（homology-directed repair, HDR），而在斷裂處導入外源性 DNA。
圖 3.14：經由 mRNA 剔低（knockdown）達成序列特異性基因沉默的機轉。A 短（小）干擾 RNA（siRNA）被解開，其「導引」反義股被納入 RNA 誘導沉默複合體（RISC）中，該複合體降解特定的標的 mRNA 序列。短髮夾 RNA（short hairpin RNA, shRNA；B）與前驅 microRNA（pre-microRNA, miRNA；C）經 Dicer 酵素處理後，可分別產生 siRNA 與 miRNA。C 內源性產生的 miRNA 調控多達三分之一的人類基因，且傾向於與標的 mRNA 有較低的互補性；它招募 RISC 蛋白，並典型地抑制 mRNA 的轉譯（而非降低 mRNA 的量）。
表 3.1：聚合酶連鎖反應。
表 3.2：大規模平行定序。
表 3.3：反轉錄 PCR（RT-PCR）。
表 3.4：Western blot。
表 3.5：螢光原位雜交（FISH）。
表 3.6：質譜蛋白體學。
表 3.7：基因轉殖小鼠。
表 3-8
表 3.9：皮膚基因治療。續。