實驗技術 (Experimental Techniques)
組織處理 (Tissue Processing)
- 常規做法（福馬林固定→石蠟包埋→H&E 染色）只是眾多起點之一。依目的可選：福馬林（光學顯微鏡）、glutaraldehyde（電子顯微鏡），或新鮮檢體冷凍後再處理切片。
- 冷凍切片組織架構品質不如福馬林固定石蠟包埋切片，但對 DNA、RNA 與蛋白質的保存優於其他固定方法。
- 新鮮或冷凍組織可直接以緩衝液與試劑處理，由全組織萃取 DNA、RNA 與蛋白質；新鮮組織亦可製成單細胞懸浮液進行單細胞分析。
- 利用選擇性培養基與分離技術，可在體外增殖所需譜系的細胞（角質細胞、纖維母細胞、免疫細胞、內皮細胞）。
分離特定細胞族群的方法
- 雷射顯微解剖 (laser microdissection)：可從組織切片中選擇顯微解剖區域進行分析。
- 流式細胞術 (flow cytometry)：組織解離為單細胞懸浮液後，細胞以單一縱列通過一組雷射與電子偵測器，可測量每個細胞的多項參數。
- 螢光活化細胞分選 (FACS)：利用靜電偏折系統取得具特定期望特徵的純細胞族群（例如以譜系專一抗體標記的細胞）。
- 質譜流式細胞術 (mass cytometry)：結合流式細胞術與元素質譜的原理，每個細胞可分析 40 項以上參數。
DNA / RNA / 蛋白質分析的基礎技術
分子生物學的核心概念統一而簡單：萃取目標分子 → 擴增至可測量的量 → 偵測。
DNA
- 聚合酶連鎖反應 (PCR)：以短的合成 DNA 序列（引子 primers）與感興趣的 DNA 區域雜合，再經多次循環複製。
- 每個循環步驟：(1) 變性——加熱至 >90°C 分開兩股 DNA；(2) 引子黏合——冷卻至 50–65°C 讓寡核苷酸引子結合模板 DNA；(3) 引子延伸——DNA 聚合酶在最適溫度 72°C 由引子開始向 3′ 端加入互補核苷酸；(4) 完整循環重複 30–40 次。
- 每個循環使 PCR 產物數目加倍；n 個循環後總產物量為原始量的 2^n 倍。
- PCR 擴增的 DNA 依引子設計典型為 50 到 2000 個鹼基對，可於膠體中以嵌入型染劑在紫外光下螢光偵測，再以螢光定序技術（Sanger sequencing）確定核苷酸序列——此法簡單、相對便宜，至今仍廣泛使用。
- 大規模平行定序 (massively parallel sequencing) / 次世代定序 (NGS)：單次執行即可讀取數百萬個 DNA 片段，成本僅略高。
- 除取得序列外，也可推論 DNA 套數變異——因最終擴增的 DNA 量與原始反應中的 DNA 套數成正比。
- 限制：更高的解析力與讀取深度需要生物資訊與精密的資料分析，在臨床實務中難以標準化。
RNA
- RNA 容易純化，但比 DNA 不穩定、降解快得多，因此分析的第一步通常是以反轉錄 (reverse transcription, RT) 轉為 DNA。
- 反轉錄酶可依所用引子以三種方式將 mRNA 轉為 cDNA：隨機六聚體引子、oligo dT 引子、基因專一引子。
- 產生的 cDNA 再以 PCR 擴增，即 RT-PCR；經修改後可準確定量極低量的 mRNA。由於每個擴增循環都監測 PCR 產物量，故稱「即時 (real-time)」定量 PCR。
蛋白質
- 細胞內蛋白量是合成與降解的複雜平衡，受多個步驟控制，包括轉譯效率與影響蛋白穩定度的轉譯後修飾。
- 西方墨點法 (Western blot / immunoblot)：溶解的蛋白混合物在聚丙烯醯胺膠上分離，電泳轉印至膜上，膜浸於含抗體的緩衝液，再以標記的二級抗體經呈色或化學發光分析偵測。除測量蛋白量外，還可判定蛋白大小與是否有不同型式。
- 酵素連結免疫吸附分析 (ELISA)：可提供蛋白的準確定量。
- 多重微珠免疫分析 (multiplex bead-based immunoassays)：最多可同時偵測 100 種分析物。以不同螢光顏色、耦合特定抗體的微珠與檢體共同培養，再依序加入二級偵測抗體與報導分子，最後以雷射激發，達成分析物結合量的定量判讀。
組織內細胞的測量
- 針對細胞族群：PCR、RT-PCR、Western blot 分別測量 DNA、RNA、蛋白質。
- 針對細胞層級的特徵，可對組織切片進行：
- 螢光原位雜合 (fluorescence in situ hybridization, FISH)：以與組織切片中目標 DNA 或 RNA 序列互補的螢光標記核酸探針雜合後，以螢光顯微鏡檢視。正常情況下體染色體基因在每個細胞核呈現兩個螢光訊號；癌細胞可能只有一個訊號（缺失）或三個以上（擴增）。作為診斷工具，FISH 可偵測單一癌細胞中的基因組異常。
- 免疫組織化學 (immunohistochemistry)：加入抗體專一結合切片中的目標蛋白，通常經酵素反應在結合處產生有色產物。可判定蛋白在組織中的位置與表現量，包括標記特定細胞譜系或細胞狀態（分化、活化、增生、凋亡）的蛋白。現已不限於單一蛋白的定量視覺化——也能偵測組織中特定的 mRNA 序列；多重 IHC 與 FISH 更可同時使用多種抗體評估。
轉錄體與蛋白質體的測量
- 轉錄體 (transcriptome)：幾乎所有細胞基因的表現量。
- RNA-seq 利用大規模平行定序評估基因表現量、基因剪接、非編碼 RNA、microRNA、基因融合與突變；現在也可對單細胞執行 RNA-seq，為人類皮膚的複雜性提供新洞見。
- 其他方法基於標記的樣本 mRNA 與置於晶片、微珠或玻片（陣列 arrays）上的已知寡核苷酸或 cDNA 序列（代表數千個基因）雜合；雜合程度即反映該基因的 mRNA 含量。
- 蛋白質體 (proteome)：特定條件下表現的所有細胞蛋白。
- 質譜 (mass spectrometry)：將蛋白離子化，測量其通過管道抵達另一端偵測器的「飛行時間 (time-of-flight)」，提供極準確的蛋白質量測定。多數情況下蛋白先經二維膠體電泳或毛細管電泳分離。
- 定量方式：以穩定同位素標記蛋白作為內部標準，或以無標記的散彈式蛋白質體學方法（分析更快、成本更低）。
- 反相蛋白陣列 (reverse-phase protein arrays)：將全蛋白裂解液點在玻片上，再以特定蛋白的抗體探測。
皮膚疾病的小鼠模式
- 基因轉殖小鼠 (transgenic mice)：傳統做法是將目標基因顯微注射入受精的小鼠卵，隨機整合入小鼠基因組。
- 雖然基因存在於每個細胞中，但可用只在特定細胞譜系表現的啟動子 (promoter) 將表現限制或導向特定組織或細胞型。啟動子啟動 mRNA 表現，位於基因編碼區上游。
- 例：要讓基因只在黑色素細胞表現，可用參與黑色素生合成之基因（如 tyrosinase）的啟動子。
- 基因剔除 (knockout) 小鼠：研究基因功能喪失。做法是製作含目標基因部分序列的靶向載體導入細胞，與內源等位基因之一雜合並修飾或刪除該基因，使無正常蛋白產生；帶有剔除基因的胚胎幹 (ES) 細胞導入早期小鼠胚胎後植入受孕母鼠，後代為嵌合小鼠，再與正常小鼠交配；欲得完全剔除小鼠則使兩隻異型合子交配。
- 條件式剔除 (conditional knockout)：以 Cre-lox 系統在特定器官或組織選擇性刪除標的基因。Cre 是位點專一的 DNA 重組酶，催化兩個 loxP 位點間的重組（切割、交換、接合），使兩 loxP 之間的 DNA 被切除並降解。將帶有「Cre 基因連結組織專一啟動子」的轉殖鼠與帶有「兩個 loxP 夾住標的基因」的轉殖鼠交配，後代同時繼承兩個構築，標的基因僅在活化該組織專一啟動子的細胞中被剔除。
- 為 Cre 重組酶加上配體結合結構域（如結合 tamoxifen 者），可達成時間上的表現控制；標的基因可依 loxP 方向被時序性地刪除、反轉或易位。
- 誘導型系統的優點：更忠實模擬病人特定組織中基因缺失的實際發生方式，重現癌症等疾病的特徵；也能避開「所有細胞都缺失基因」常影響小鼠正常發育的問題。除 tamoxifen 控制 Cre 外，亦可用 “Tet-On/Off” 系統解決基因缺失導致胚胎死亡的問題。
- CRISPR-Cas9 基因組編輯工具的發現革新並加速了小鼠模式的建構，可在標定的 DNA 位點精確引入突變。
- 機轉：單導引 RNA (sgRNA) 以 20 個核苷酸的導引序列標定緊鄰 PAM (protospacer adjacent motif) 的基因組 DNA；髮夾結構招募 Cas9 形成複合體結合標的序列，Cas9 在 PAM 上游三個核苷酸處切斷雙股 DNA。
- 雙股斷裂修復途徑：非同源末端接合 (NHEJ) 產生短插入或缺失而破壞基因功能（knockout）；若有 DNA 修復模板則可經同源導向修復 (HDR) 引入外源 DNA（knock-in）。
皮膚疾病的基因治療
- 基因治療是操縱 DNA 或 RNA，在標的組織細胞中加入或矯正基因以達治療效果。
- 雖可在體內 (in vivo) 直接投予病人皮膚，但有安全性與生殖細胞系基因改變的疑慮，因此發展出離體 (ex vivo) 技術：由皮膚檢體培養細胞、體外處理後再移植回病人。
- 幹細胞較受青睞，因其基因操作可能帶來長期植入與穩定效益；但成體組織可取得的幹細胞數量有限，故對使用 iPS 細胞的基因治療興趣濃厚。人類皮膚培養的纖維母細胞經轉錄因子處理可重編程為 iPS 細胞，具多能性且可在體外無限增殖；病人的 iPS 細胞可先基因矯正、再分化為所需細胞型（如角質細胞）移植回病人。
操縱 DNA 的方式
- 導入基因新副本（補償功能喪失），可用非病毒或病毒載體：
- Sleeping Beauty：非病毒的剪貼式 DNA 轉位子，相較只用目標基因 DNA 能改善長期基因表現；但因可能隨機插入原致癌基因附近使其活化，有插入性突變的風險。
- 病毒載體：包括自我不活化的慢病毒與 gamma 反轉錄病毒載體，會整合入基因組，插入性突變風險低於早期反轉錄病毒載體。缺點：免疫原性、廣泛的趨性 (tropism)、DNA 包裝容量有限。
- 矯正內源基因（而非插入基因）可避開插入性突變的併發症。標的基因矯正方法包括鋅指核酸酶 (ZFNs)、類轉錄活化因子效應核酸酶 (TALENs)，以及最重要的 CRISPR-Cas9。
- 這些核酸酶具序列專一的 DNA 結合模組連結 DNA 切割結構域，可在指定位點誘發雙股斷裂；雙股斷裂提高同源導向修復的頻率，使共同投遞、帶延伸同源臂的質體得以矯正既有基因。
- 標定特定 mRNA 使其降解：設計長度 21–23 個核苷酸、與目標 mRNA 互補的雙股 RNA。
- 合成的反義寡去氧核苷酸 (AS-ODNs) 送入細胞後，透過內源蛋白複合體 RNA 誘導沉默複合體 (RISC) 媒介序列專一的 mRNA 降解。
- AS-ODN 技術正被投遞短干擾 RNA (siRNA) 與 microRNA (miRNA) 的合成載體取代，包括脂質或聚合物奈米顆粒，以及動態聚共軛物 (dynamic polyconjugates) 與 GalNAc 共軛物等共價投遞系統。這些方法在實驗室已成功應用，並正進行臨床試驗。
圖 3-1：組織處理。同一組織檢體可用多種方式處理以分析 DNA、RNA 或蛋白質。FACS：螢光活化細胞分選。
圖 3-13：CRISPR-Cas9 技術媒介的基因組工程。sgRNA 以 20 個核苷酸導引序列標定緊鄰 PAM 的基因組 DNA，招募 Cas9 在 PAM 上游三個核苷酸處切斷雙股 DNA；斷裂可經 NHEJ 修復（產生破壞基因功能的短插入或缺失），或在有修復模板時經 HDR 引入外源 DNA。
表 3-9：皮膚的基因治療。